安捷伦BioTek Synergy微孔板检测仪

本文转载自安捷伦细胞分析微信公众号。

实验室常用的核酸检测方法有A260/A280吸收光检测法和荧光检测法。其中吸收光检测法主要用于核酸纯度检测和浓度检测，但是受限于吸收光方法学的局限性，浓度检测准确度和灵敏度相比荧光方法要低。

荧光检测法使用的荧光染料能够特异地与核酸分子相结合，在特定波长光源的激发下发出荧光，核酸浓度在一定范围内与荧光强度成正比，可有效区分出双链 DNA 、单链 DNA 和 RNA ，同时不受游离核苷酸、蛋白、盐离子和其他杂质的干扰。此外，与核酸结合的染料相较其游离态荧光信号增强数十倍至数百倍，使检测结果可以获得更高的信噪比。

因此，对于一些需要精确测定低浓度样本的实验，荧光染料法是不可或缺的，例如基因芯片、测序文库构建等。在新一代测序实验中，核酸样品的准确定量对核酸的片段化效果有直接的影响，例如在使用酶切方法时，过高的核酸浓度使得酶切不完全，导致文库中大片段偏多；而过低的核酸浓度容易导致酶切过度，造成小片段增多。

传统的荧光染料法使用微量离心管检测，通量低且检测时间长，满足难以满足大基数样本的快速定量。采用 96 孔微孔板结合酶标仪进行荧光染料法核酸定量，既能满足低浓度样本精确定量的需求，又实现了高通量检测的目的。安捷伦BioTek Synergy 系列多功能酶标仪产品，已在该方向上为许多实验者解决了燃眉之急。

下面笔者将以 Qubit®dsDNA BR Assay Kit 在 Synergy Neo2 上的应用为例，为大家介绍使用 Synergy 系列多功能微孔板检测仪制作标准曲线并测定 DNA 浓度的方法。

材料：

·Qubit®dsDNA BR Assay Kit (Invitrogen，# Q32850)

·纯化的鲱鱼精子 DNA (Sigma-Aldrich, # D6898)，于 TE 缓冲液中保存

·TE 缓冲液 (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0).

·96 孔黑色平底聚苯乙烯微孔板(Corning, #3915)

·量程为 10 -200μL 的移液器

·GFP 滤光片 Cube（PN 1035108 EX 485/20 EM 530/25，DM 510）

·

方法：

·用缓冲液将 200× 浓缩液稀释 200 倍。

·为适配试剂本身的分析范围，将 TE 缓冲液中的 2.2 mg/mL 鲱鱼精子 DNA 溶液梯度稀释成 4 个梯度：0.1 、1 、10 和1000 ng/µL 。

·用移液器将样品和 10 µL DNA 标准品添加到 96 孔板中，然后添加适量的工作液使最终体积为 200µL ，室温孵育 5 分钟后上机检测。

程序设定：

1. 在孔板类型下拉菜单中选择“96-well plate”

2. 在检测方法界面依次选择“荧光强度”-“终点/动力学”-“滤光片”

3. 在检测步骤界面设置好标签，选择单 PMT 顶部检测，下拉选择“485/528”滤光片组，增益设置为 50

板布局：

设置标准品、本底和样品位置，并根据配置的标准品浓度进行标注

数据处理：

1. 本底扣除

2. 标准品曲线设置：将 X 轴设置为浓度，Y 轴为扣除本底的 528nm 处荧光值，曲线拟合选择四参数非线性回归，并将轴演示都设置为对数

结果：

在 Gen5™ 中绘制四参数非线性拟合的标准曲线，显示相关性良好

上述实验表明，Synergy Neo2 可以提供有效的高通量核酸荧光定量方法。

除此之外，Synergy 系列多功能微孔板检测仪提供三种震板模式和恒温孵育功能，实验者可预先设置程序，在完成加样后直接将 96 孔板放入检测仪中进行混匀和避光孵育，无需繁复操作，直接检测。Synergy Neo2 在检测速度和灵敏度上具有无可比拟的巨大优势：可以在 6 秒内完成 96 孔板的荧光强度检测；当使用 384 孔板检测时，顶部检测模块荧光检测灵敏度高达 0.2 pM 。

荧光染料法可以测定单种核酸的浓度却无法鉴定样品纯度，但在实际操作中，样品的纯度也是保证实验结果可靠的重要因素。核酸纯度通常由紫外分光光度法得到，主要以核酸在 260nm 和 280nm 处吸光度的比值衡量。

Synergy 系列多功能微孔板检测仪不仅支持荧光强度的检测，还提供全波长吸收光检测和发光检测。搭配 Take3 或 Take3 Trio 微量核酸浓度检测板和 Gen5™ 预设程序，可在一次运行中测定 16 或 48 个样品，实现高通量紫外吸收光核酸定量，大大提高检测效率。拥有一台仪器即可完成高质量微量核酸浓度和纯度测定，为核酸浓度测定提供真正的高通量解决方案。

高通量解决方案

Agilent BioTek Synergy 系列多功能微孔板检测仪，可实现全波长吸收光、荧光和化学发光检测。独特的 Hybrid 技术可为多种应用提供出色的灵敏度和灵活性：四光栅系统支持全波长荧光检测，波长灵活选择，带宽连续可调（Synergy H1 为 9 ~ 50 nm，Synergy Neo2 为 3 ~ 50 nm ），能够更好地兼顾荧光探针的特异性和灵敏度；滤光片系统搭载灵敏的高透射滤光片，支持均相时间分辨荧光（HTRF）、荧光偏振（FP）等高级荧光检测。二者光路独立，可确保在所有检测模式下具有出色的性能。

BioTek Synergy Neo2 应用范围极广，适用于各类药物筛选、分子相互作用、细胞代谢、细胞因子检测等方向，涵盖细胞、分子、药物等多个领域的实验需求。此外，Synergy Neo2 可装配用于 ALPHA 和 TRF 检测的激光器，有效提高灵敏度和读取速度。4 个 PMT 提供超快测量速度，顶部双 PMT 模块可同时进行两次测量，能同时采集两个发射信号，有效地将测量速度提高一倍，可以一次性获得 FP 、FRET 和 TR-FRET 测量结果，节省实验时间。同时，四区温控技术提供稳定温度控制，外接气控模块控制舱内 O2与 CO2浓度，为活细胞的长期检测提供了适宜的环境条件。

仅限研究使用。不可用于诊断目的。